تهیه زیست حسگرهای نوین برای بررسی دورگه سازی dna با استفاده از ابزارهای الکتروشیمیایی بر مبنای کاوشگرهایdna و pna جهت مطالعه نقص های ژنتیکی

در این پایان نامه، زیست حسگرهای جدیدی برای بررسی دورگه سازی dna با استفاده از ابزارهای الکتروشیمیایی جهت مطالعه نقص های ژنتیکی تهیه گردید. از توالی های کوتاه ژن p53 و اینترلوکین-2 به عنوان مدل برای طراحی ژن حسگرها استفاده شد. در اولین مطالعه، ساده ترین الکترود کار، الکترود خمیر کربن (cpe)، که با نانولوله های کربنی اصلاح شده بود (cntpe)، به کار رفت. خصوصیات سطح الکترود cpe و cntpe با استفاده از اسپکتروسکوپی امپدانس الکتروشیمیایی(eis) بررسی شد. قطر نیمدایره در نمودارeis مربوط به cntpe نسبت به cpe کاهش یافت که نشانگر افزایش رسانایی سطح الکترود کار می باشد. پس از تثبیت کاوشگر dna بر روی الکترود کار، از علامت ذاتی اکسایش گوانین که توسط ولتامتری پالس تفاضلی(dpv) ثبت شد، به منظور شناسایی dna های هدف مکمل و غیرمکمل استفاده گردید. مقایسه ارتفاعdpv نشان می دهد که علامت اکسایش گوانین در cntpe تقریباً دو برابر آن در cpe است. متغیرهای گوناگونی نظیر زمان و پتانسیل در مرحله پیش فعالسازی الکترود کار و تثبیت کاوشگر بر روی آن، بهینه شدند. در بخش دوم این تحقیق از الکترود خمیر کربن، کاوشگر dna و از بریلیانت کریسیل بلو (bcb) به عنوان نشانگر یا شناساگر استفاده شد. از طیف سنجی فرابنفش- مرئی (uv-vis) برای بررسی پیوند مولکول های bcb با dna و از ولتامتری چرخه ای (cv) برای مطالعه الکتروشیمیایی برهمکنش bcb و dna استفاده گردید. درطیف های آزمایش uv-vis، جابه جایی یک طرفه به سمت طول موج های بالاتر یا پایین تر، جود ندارد و اثر کاهش جذب، مشهودتر است، بنابراین برهمکنش الکتروستاتیک بین bcb با بار مثبت و گروه های منفی فسفات dna تایید می شود. نتایج آزمایش های ولتامتری چرخه ای نشان می دهد که در حضور dna، ارتفاع دماغه های آندی و کاتدی bcb افزایش و میزان جدایی پتانسیلی دماغه ها کاهش می یابد که بیانگر تسریع فرایند اکسایش و کاهش ملکولهای bcb و برهمکنش شدید آن با dna می باشد. تکنیک dpv به منظور بررسی رفتار الکتروشیمیایی سطح الکترود کار قبل و بعد از تثبیت کاوشگر و فرایند دورگه سازی انتخاب شد. ارتفاع dpv مربوط به bcb تجمع یافته بر سطح cpe برهنه به طور قابل ملاحظه ای کمتر از ارتفاع آن، در سطح cpe اصلاح شده با کاوشگر است. این مقایسه نشان می دهد که مقادیر قابل ملاحظه ای از bcb بر روی سطح cpe اصلاح شده با کاوشگر تجمع می یابد. بنابراین فرایند دورگه سازی کاوشگر تثبیت شده بر روی سطح cpe را با dnaی هدف مکمل می توان به کمک تغییرات ارتفاع ولتاموگرام پالس تفاضلی bcb های تجمع یافته بر روی cpe بررسی کرد. در بخش سوم، از کاوشگر pna برای بررسی جهش نقطه ای ژن p53، از متیلن بلو به عنوان نشانگر الکتروشیمیایی و از الکترود طلا به عنوان الکترود کار مناسب استفاده گردید. در این مطالعه، الیگونوکلئوتید کاوشگر با استفاده از اتصال سیستئین تیول دار بر روی بستر طلا، تک لایه خودانباشته تشکیل داده، سپس فرایند دورگه سازی با dna های هدف مکمل، غیر مکمل و تک باز اشتباه با روش های dpv وeis مورد بررسی قرار گرفت. با در نظر گرفتن ساختار خنثای pna و وجود یک عدد بازگوانین در ساختار کاوشگر، برهمکنش بین متیلن بلو و کاوشگر از نوع درزگیری است. برای دستیابی به عملکرد بهتر زیست حسگر در تمایز گذاری بین dnaی هدف مکمل و هدف حاوی باز اشتباه، غلظت کاوشگر و dnaها بهینه شد. در بخش چهارم، از ایندیگوکارمین (ic) به عنوان نشانگر، از کاوشگر pna و از الکترود طلا استفاده گردید. از آنجایی که ایندیگوکارمین فقط در محیط اسیدی الکتروفعال است، اندازه گیری های ولتامتری در سولفوریک اسید انجام شد. مهمترین نوآوری این تحقیق، بررسی فرایند دورگه شدن در محیط اسیدی است. نتایج حاصل نشان می دهد که دورگه تشکیل شده بین pnaی کاوشگر وdna ی هدف مکمل به اندازه کافی پایدار بوده و درمحیطی با ph برابر یک، پیوند های آن شکافته نمی گردد. در بررسی های انجام شده تا اینجا، از الیگونوکلئوتیدهای تک رشته کوتاه زنجیر، به عنوان dnaی هدف استفاده شد. در مراحل پایانی کار، نمونه های بیولوژیکی پیچیده نظیر تشکیل ساختار سه رشته ای از dna، نمونه های واکنش زنجیره ای پلیمراز (pcr) و پلازمید، بررسی گردید. در تشخیص تشکیل ساختار سه رشته از شناساگر متیلن بلو و تک لایه های خود انباشته pna برای تثبیت کاوشگر بر روی الکترود طلا استفاده شد. با کاهش غلظت pna در مرحله تثبیت کاوشگر، ارتفاع جریان احیاء الکتروشیمیایی متیلن بلوی تجمع یافته در سطح کاوشگر نیز کاهش می یابد که نشان دهنده میزان کمتر تجمع نشانگر بر روی کاوشگر است. از طرف دیگر، پس از انجام مرحله سه رگه سازی، ارتفاع جریانdpv افزایش می یابد که خود دلیلی بر تأیید تشکیل سه رگه می باشد. برای شناسایی جهش نقطه ای در محصولات pcr ژن p53، از تکنیک دورگه سازی ساندویچی و از سیستم سنجش های ایمونوسوربنت متصل شده به آنزیم (elisa) استفاده گردید. برای تثبیت کاوشگر، نانوذرات پارامغناطیسی و الکترودهای شبکه چاپی گرافیت به کار رفت. از آنزیم الکالین فسفاتاز برای تولید سیگنال لازم جهت بررسی پیشرفت واکنشها استفاده شد. محصول واکنش آنزیمی تولید شده، الکترو فعال است که با تکنیک dpv یک دماغه اکسیدی بلند ظاهر می سازد. ارتفاع دماغه، معیاری از کارایی فرایند دورگه سازی است. هر چه غلظت dnaی هدف بیشتر باشد، دورگه سازی بیشتری بین dnaی هدف و کاوشگر رباینده صورت می گیرد. در نتیجه مقدار بیشتری از کاوشگر علامت دهنده در طی فرایند ساندویچ شدن به dna هدف، متصل می شود. از آنجایی که کاوشگر علامت دهنده، بیوتین دارد، پس مقدار بیشتری از آنزیم آلکالین فسفاتاز متصل به استرپتاویدین با آن پیوند می دهند. هر چه مقدار آنزیم بیشتر، پیشرفت واکنش آنزیمی بیشتر، در نتیجه مقدار بیشتری از سوبسترا به محصول تبدیل می شود. محصول بیشتر، دماغه اکسیدی بلندتری ظاهر می سازد. به منظور افزایش حساسیت، از دستگاه گراوی چیپ استفاده شد. اساس عملکرد این دستگاه، آشکارسازی الکتروشیمیایی با تکنیک کرونوآمپرومتری است که به طور همزمان در سطح هشت میکروالکترود، میتوان هشت غلظت مختلف از dna هدف را اندازه گرفت. در آخرین قسمت ازاین کار تحقیقاتی، نمونه های پلازمید ژن p53مورد آزمایش واقع شد. در این کار، کاوشگر pna که بر روی الکترودهای شبکه چاپی طلا، تک لایه های خود انباشته تشکیل داد، به کار رفت. پس از انجام فرایند دورگه سازی، از علامت کاهش الکتروشیمیایی متیلن بلوی تجمع یافته بر روی الکترود طلای اصلاح شده با کاوشگر، برای شناساییdna های هدف گوناگون استفاده شد.